특허있는 코로나 바이러스, Patented corona virus

https://patents.justia.com/patent/1...vORKsFANUxMRNEfWime6h69CNdtHk9d6AhvV7L23RiIZY

== 주의 : 기계번역

코로나 바이러스

2015 년 7 월 23 일 - 저작권 연구소
본 발명은 하나 이상의 비 구조 단백질 (들) (nsp) -10, nsp-14, nsp-15 또는 nsp-16 중 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 폴리 단백질을 코딩하는 변이 복제 유전자를 포함하는 약독 화 생 코로나 바이러스를 제공한다. 코로나 바이러스는 대상체에서 감염성 기관지염과 같은 질병을 치료 및 / 또는 예방하기위한 백신으로서 사용될 수있다.
최신 PIRBRIGHT INSTITUTE 특허 :

• 아프리카 돼지 열병 바이러스 백신
• 안정화 된 FMDV 캡시드
• 안정화 된 FMDV 캡시드
• 바이러스 생산 개선을위한 닭 세포
• 감염성 기관지염 바이러스 (IBV)의 조직 트로피 즘을 확장하는 돌연변이 스파이크 단백질

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기술
발명의 분야
본 발명은 바이러스가 병원성을 감소시키는 변이 복제 유전자를 포함하는 약독 화 코로나 바이러스에 관한 것이다. 본 발명은 또한 질병을 예방 및 / 또는 치료하기위한 백신에서의 이러한 코로나 바이러스의 용도에 관한 것이다.
발명의 배경
전염성 기관지염 (IB)의 병인 인 조류 전염성 기관지염 바이러스 (IBV)는 주로 호흡기뿐만 아니라 장, 신장 및 난관의 상피 세포에서 복제되는 가금류의 전염성 및 전염성 병원체입니다. IBV는 Nidovirales, Family Coronaviridae, Subfamily Corona virinae 및 Gammacoronavirus 계열의 일원입니다 . 유 전적으로 매우 유사한 코로나 바이러스는 칠면조, 기니 닭 및 꿩에서 질병을 유발합니다.
IB의 임상 징후에는 재채기, 기관 첩자, 코 분비물 및 천명음이 포함됩니다. 육류 용 조류는 체중 증가가 줄어든 반면, 알을 낳는 조류는 계란이 적고 품질이 낮은 계란을 생산합니다. 호흡기 감염은 닭을 치명적일 수있는 2 차 세균 감염에 닭을 소생시킵니다. 바이러스는 또한 특히 병아리에서 난관에 영구적 인 손상을 일으켜 알 생산과 품질을 떨어 뜨릴 수 있습니다. 신장, 때로는 치명적일 수있는 신장 질환을 유발합니다.
IBV는 다른 전염병보다 가금류 산업에 더 많은 경제적 손실을 일으키는 것으로보고되었습니다. 약독 화 생백신 및 불 활성화 백신이 IBV의 제어에 보편적으로 사용되지만, 백신 사용으로 인한 보호는 백신 고장 또는 사용 된 백신과 관련이없는 새로운 IBV 혈청 형의 도입으로 인해 손실 될 수 있습니다. 가금류 산업에 대한 위험.
또한, 백신 접종 프로그램의 효율 및 비용 효율성을 향상시키기 위해, ovo에 사용하기에 적합한 백신을 개발할 필요가있다. 난소 백신 접종과 관련된 주요 도전 과제는 바이러스가 배아에 병원성이 없어도 바이러스에 대해 모계 유래 항체가 존재하는 경우 복제 할 수 있어야한다는 것입니다. 현재의 IBV 백신은 발육란에서 다중 계대 배양 후 유래되며, 이는 닭에 대한 병원성이 감소 된 바이러스를 초래하여 생 약독 화 백신으로 사용될 수있다. 그러나 이러한 바이러스는 거의 항상 배아에 대한 독성이 증가하므로 난소 백신 접종에 사용할 수 없으므로 부화가 감소합니다. 경우에 따라 해칭 성이 70 % 감소합니다.
배아 알에서 다중 계대 후의 감쇠는 또한 다른 단점을 겪는다. 바이러스의 감쇠는 무작위 적이며 바이러스가 통과 될 때마다 다를 수 있으므로 실험적인 방법입니다. 따라서 감쇠 목적으로 다른 일련의 난을 통해 동일한 바이러스를 통과 시키면 다른 돌연변이 세트가 감쇠로 이어질 것입니다. 공정과 관련된 효능 문제도 있습니다 : 일부 돌연변이는 바이러스의 복제에 영향을 미치며 일부 돌연변이는 바이러스를 너무 약화시킬 수 있습니다. 면역 원성에 영향을 줄 수있는 S 유전자에서도 돌연변이가 발생할 수 있으며, 따라서 원하는 면역 반응에 영향을 미치고 잠재적 백신이 필요한 혈청 형을 막지 못할 수 있습니다. 또한, 백신의 독성 및 안정성으로의 복귀와 관련된 문제가있다.
IBV 관리를 위해 새롭고 안전한 백신을 개발하는 것이 중요합니다. 따라서, 이러한 문제와 관련이없는 IBV 백신, 특히 난소 백신 접종에 사용될 수있는 백신이 필요하다.
본 발명의 측면의 요약
본 발명자들은 IBV를 합리적으로 약화시키기 위해 역 유전학 접근법을 사용 하였다. 이 접근법은 각 돌연변이의 위치가 알려져 있고 바이러스에 미치는 영향, 즉 감쇠의 이유가 유도 될 수 있기 때문에, 배아 난에서의 다중 계대 후 무작위 감쇠보다 훨씬 더 제어 가능하다.
본 발명자들은 그의 역 유전학 접근법을 이용하여 바이러스가 병원성 수준을 감소시키는 다양한 돌연변이를 확인 하였다. 바이러스가 배아 알에 투여 될 때, 배아에 병원성이없는 복제가 가능하도록 병원성의 수준이 감소 될 수있다. 이러한 바이러스는 난소 백신 접종에 적합 할 수 있는데, 이는 중요한 이점이며, 배아 난에서의 다중 계대 후 생성 된 약독 화 IBV 백신에 비해 개선된다.
따라서, 제 1 측면에서, 본 발명은 하나 이상의 비 구조 단백질 (들) (nsp) -10, nsp-14, nsp-15 중 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 폴리 단백질을 코딩하는 변이체 복제 유전자를 포함하는 생 약독 화 코로나 바이러스를 제공한다 또는 nsp-16.
변이 복제 유전자는 다음의 목록으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함하는 단백질을 암호화 할 수있다 :

• 
  
  • 서열 번호 : 6의 위치 85에서 Leu로 프로,
  • 서열 번호 : 7의 위치 393에서 Val 내지 Leu;
  • 서열 번호 : 8의 위치 183에서 Leu 내지 Ile;
  • 서열 번호 : 9의 위치 209에서 Val까지

복제 유전자는 서열 번호 6의 85 번 위치에서 아미노산 돌연변이 Pro를 Leu로 포함하는 단백질을 암호화 할 수있다.
복제 유전자는 서열 번호 7의 위치 393에서 아미노산 돌연변이 Val to Leu를 포함하는 단백질을 암호화 할 수 있고; 서열 번호 : 8의 위치 183에서 Leu 내지 Ile; 및 서열 번호 9의 위치 209에서 Val to Ile.
복제 유전자는 서열 번호 6의 위치 85에서 아미노산 돌연변이 Pro를 Leu로 포함하는 단백질을 암호화 할 수 있고; 서열 번호 : 7의 위치 393에서 Val에서 Leu로; 서열 번호 : 8의 위치 183에서 Leu 내지 Ile; 및 서열 번호 9의 위치 209에서 Val to Ile.
복제 유전자는 다음의 목록으로부터 선택된 하나 이상의 뉴클레오티드 치환을 포함 할 수있다 :
뉴클레오티드 위치 12137에서 C 내지 T;
뉴클레오티드 위치 18114에서 G 내지 C;
뉴클레오티드 위치 19047에서 T가 A로; 과
뉴클레오티드 위치 20139에서 G 내지 A;
서열 번호 1로 나타낸 서열과 비교.
코로나 바이러스는 감염성 기관지염 바이러스 (IBV) 일 수 있습니다.
코로나 바이러스는 IBV M41 일 수있다.
코로나 바이러스는 적어도 일부가 M41 이외의 IBV 혈청 형 유래의 S 단백질을 포함 할 수있다.
예를 들어, S1 서브 유닛 또는 전체 S 단백질은 M41 이외의 IBV 혈청 형으로부터 유래 될 수있다.
본 발명의 제 1 측면에 따른 코로나 바이러스는 상응하는 야생형 복제물을 발현하는 코로나 바이러스와 비교하여 병원성이 감소되어, 바이러스가 배아 난에 투여 될 때 배아에 병원성이없는 복제가 가능하다.
제 2 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제 1 측면과 관련하여 정의 된 변이 복제 유전자를 제공한다.
제 3 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제 2 측면에 따른 변이 코로나 바이러스 복제 유전자에 의해 암호화 된 단백질을 제공한다.
제 4 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제 2 측면에 따른 복제 유전자를 포함하는 플라스미드를 제공한다.
제 5 측면에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 본 발명의 제 1 측면에 따른 코로나 바이러스의 제조 방법을 제공한다 :

• 
  
  • (i) 본 발명의 제 4 측면에 따른 플라스미드를 숙주 세포로 형질 감염시키는 단계;
  • (ii) 복제 세포로 코로나 바이러스 균주의 게놈을 포함하는 재조합 바이러스로 숙주 세포를 감염시키는 단계;
  • (iii) 플라스미드의 복제 유전자 서열과 재조합 바이러스 게놈의 상응하는 서열 사이에 상동 재조합이 일어나 변형 된 복제 유전자를 생성하는 단계; 과
  • (iv) 변형 된 복제 유전자를 포함하는 재조합 바이러스를 선별하는 단계.

재조합 바이러스는 백시 니아 바이러스 일 수있다.
방법은 또한 단계를 포함 할 수있다 :

• 
  
  • (v) 단계 (iv)의 재조합 바이러스로부터 DNA로부터 변형 된 복제 유전자를 포함하는 재조합 코로나 바이러스를 회수하는 단계.

제 6 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제 1 측면에 따라 코로나 바이러스를 생산할 수있는 세포를 제공한다.
제 7 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제 1 측면에 따른 코로나 바이러스 및 약제 학적으로 허용되는 담체를 포함하는 백신을 제공한다.
제 8 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제 7 측면에 따른 백신을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 질환을 치료 및 / 또는 예방하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 양태는 다음을 제공한다 :

• 
  
  • 대상체에서 질환을 치료 및 / 또는 예방하는데 사용하기위한 본 발명의 제 7 측면에 따른 백신.
  • 대상체에서 질환을 치료 및 / 또는 예방하기위한 백신의 제조에있어서 본 발명의 제 1 측면에 따른 코로나 바이러스의 용도.

이 질병은 전염성 기관지염 (IB) 일 수 있습니다.
백신의 투여 방법은하기로 이루어진 군으로부터 선택 될 수 있으며; 점안제 투여, 비강 내 투여, 식수 투여, 해치 후 주사 및 난내 주사.
예방 접종은 난소 예방 접종에 의한 것일 수 있습니다.
본 발명은 또한 본 발명의 제 6 측면에 따른 코로나 바이러스로 본 발명의 제 6 측면에 따른 세포를 감염시키는 단계를 포함하는 본 발명의 제 7 측면에 따른 백신의 제조 방법을 제공한다.
도면의 설명
무화과. 1-CK 세포에서 M41-CK (M41 EP4)와 비교 한 M41-R-6 및 M41-R-12의 성장 동역학
무화과. 2-M41-CK (M41 EP4) 및 Beau-R과 비교하여 M41-R-6 및 M41-R-12와 관련된 임상 징후, 틈새 및 천명음 (막대는 모의, Beau-R, M41-R 6, M41- R 12, M41-CK EP4 (각 시점의 왼쪽에서 오른쪽).
무화과. 삼-감염된 병아리로부터 채취 한 기관에서 분리 된 기관 고리에서 바이러스의 섬모 활동. 100 % 섬모 활동은 바이러스에 의한 영향이 없음을 나타냅니다. 무 병원성, 0 % 활동은 섬모 활동의 완전한 소실, 완전한 ciliostasis를 나타냅니다. 바이러스가 병원성임을 나타냅니다 (막대는 모의, Beau-R, M41-R 6, M41-R 12, M41-CK EP4를 각 시점의 왼쪽에서 오른쪽으로 표시합니다) ).
무화과. 4-M41-R-12 및 M41-CK (M41 EP5)와 비교하여 M41R-nsp10rep 및 M41R-nsp14,15,16rep와 관련된 임상 징후, 스 니킹 (바는 모의, M41-R12; M41R-nsp10rep; M41R-nsp14 표시) , 15,16rep 및 M41-CK EP5 (각 시점의 왼쪽에서 오른쪽).
무화과. 5-감염된 병아리에서 채취 한 기관에서 분리 된 기관 고리에서 M41-R-12 및 M41-CK에 비해 M41R-nsp10rep 및 M41R-nsp14,15,16rep의 섬모 활동 각 시점의 왼쪽에서 오른쪽으로 -nsp14,15,16rep 및 M41-CK EP5).
무화과. 6-M41-CK와 비교 한 M41R-nsp10, 15rep, M41R-nsp10, 14, 15rep, M41R-nsp10, 14, 16rep, M41R-nsp10, 15, 16rep 및 M41-K와 관련된 임상 징후, 스 니킹 (바 표시 모의) , M41R-nsp10,15rep1; M41R-nsp10,14,16rep4; M41R-nsp10,15,16rep8; M41R-nsp10,14,15rep10; M41-K6 및 M41-CK EP4 (각 시점의 왼쪽에서 오른쪽).
무화과. 7-M41-CK와 비교 한 M41R-nsp10, 15rep, M41R-nsp10, 14, 15rep, M41R-nsp10, 14, 16rep, M41R-nsp10, 15, 16rep 및 M41-K와 관련된 임상 징후, 천명음 (막대는 모의 표시) , M41R-nsp10,15rep1; M14R-nsp10,14,16rep4; M41R-nsp10,15,16rep8; M41R-nsp10,14,15rep10; M41-K6 및 M41-CK EP4 (각 시점의 왼쪽에서 오른쪽).
무화과. 8-기관으로부터 분리 된 기관 고리에서 M41-CK와 비교 한 M41R-nsp10, 15rep, M41R-nsp10, 14, 15rep, M41R-nsp10, 14, 16rep, M41R-nsp10, 15, 16rep 및 M41-K의 섬모 활성 감염된 병아리 (바는 왼쪽에서 오른쪽으로 모형, M41R-nsp10,15rep1; M41R-nsp10,14,16rep4; M41R-nsp10,15,16rep8; M41R-nsp10,14,15rep10; M41-K6 및 M41-CK EP4 표시) 각 시점).
무화과. 9-CK 세포에서 M41-CK와 비교 한 rIBV의 성장 동역학. 무화과. 9A M41-R 및 M41-K에 대한 결과를 보여줍니다. 무화과. 9BM41-nsp10 대표에 대한 결과를 보여준다; M41R-nsp14, 15, 16 회; M41R-nsp10, 15 회; M41R-nsp10, 15, 16 회; M41R-nsp10, 14, 15 회; 및 M41R-nsp10, 14, 16.
무화과. 10-돌연변이 된 nsp10, nsp14, nsp15 및 nsp16 서열에서 아미노산 돌연변이의 위치.
무화과. 11-A); 거리기; B) 호흡기 증상 (천명 및 천명 결합) 및 C) M41-CK와 비교하여 rIBV M41R-nsp 10,14 회 및 rIBV M41R-nsp 10,16 회 대장의 섬모 활동 -nsp10,16rep 및 M41-K (각 시점의 왼쪽에서 오른쪽).
상세 설명
본 발명은 코로나 바이러스에서 발현 될 때, 야생형 복제 유전자를 포함하는 상응하는 코로나 바이러스에 비해 바이러스가 병원성을 감소시키는 변이 복제 유전자를 포함하는 코로나 바이러스를 제공한다.
코로나 바이러스
감마 코로나 바이러스는 코로나 비리 대과 에 속하는 동물 바이러스의 속이다. 코로나 바이러스는 포지티브-센스 단일 가닥 RNA 게놈 및 나선형 대칭을 갖는 외피 바이러스이다.
코로나 바이러스의 게놈 크기는 대략 27 내지 32 킬로베이스의 범위이며, 이는 임의의 공지 된 RNA 바이러스에 대해 가장 긴 크기이다.
코로나 바이러스는 주로 포유류와 조류의 상부 호흡기 또는 위장관을 감염시킵니다. 현재 알려진 5 ~ 6 개의 다른 코로나 바이러스 균주가 인간을 감염시킵니다. 중증 급성 호흡기 증후군 (SARS)을 유발하는 가장 널리 알려진 인간 코로나 바이러스 인 SARS-CoV는 상부 및 하부 호흡기 감염을 유발하고 위장염을 유발할 수 있기 때문에 독특한 병인을 가지고 있습니다. 중동 호흡기 증후군 코로나 바이러스 (MERS-CoV)는 또한 인간의 호흡기 감염을 낮 춥니 다. 코로나 바이러스는 성인의 모든 감기에 상당한 비율을 유발하는 것으로 생각됩니다.
코로나 바이러스는 또한 가축 동물과 길 들여진 애완 동물에게 다양한 질병을 일으키며, 그 중 일부는 심각 할 수 있으며 농업 산업에 위협이됩니다. 가축 동물의 경제적으로 중요한 코로나 바이러스에는 닭의 호흡기 질환을 유발하고 전세계 가금류 산업에 심각한 영향을 미치는 감염성 기관지염 바이러스 (IBV); 돼지 코로나 바이러스 (전염성 위장염, TGE)와 소 코로나 바이러스는 어린 동물에서 설사를 유발합니다. 고양이 코로나 바이러스에는 두 가지 형태가 있습니다. 고양이 장 코로나 바이러스는 임상 적으로 미미한 병원체이지만이 바이러스의 자발적인 돌연변이는 사망률과 관련된 질병 인 고양이 감염성 복막염 (FIP)을 유발할 수 있습니다.
경증 위장병을 유발하는 것과 호흡기 질환을 일으키는 것으로 밝혀진 두 가지 유형의 개 코로나 바이러스 (CCoV)도 있습니다. 마우스 간염 바이러스 (MHV)는 코로나 바이러스로, 특히 실험용 쥐의 식민지에서 사망률이 높은 전염병을 유발합니다.
코로나 바이러스는 아래와 같이 네 그룹으로 나뉩니다.

• 
  
  • 알파
    
    • 송곳니 코로나 바이러스 (CCoV)
    • 고양이 코로나 바이러스 (FeCoV)
    • 인간 코로나 바이러스 229E (HCoV-229E)
    • 돼지 전염성 설사 바이러스 (PEDV)
    • 전염성 위장염 바이러스 (TGEV)
    • 휴먼 코로나 바이러스 NL63 (NL 또는 New Haven)
    
    
  • 베타
    
    • 소 코로나 바이러스 (BCoV)
    • 송곳니 호흡 코로나 바이러스 (CRCoV) —SE 아시아 및 미크로네시아에서 일반적
    • 휴먼 코로나 바이러스 OC43 (HCoV-OC43)
    • 마우스 간염 바이러스 (MHV)
    • 돼지 혈구 응집 뇌척수염 바이러스 (HEV)
    • 쥐 코로나 바이러스 (Roy). 쥐 코로나 바이러스는 2008 년 3 월 / 4 월 현재 토착 및 야생 설치류 식민지에서 발견 된 동부 호주에서 널리 퍼져 있습니다.
    • (아직 일반적인 이름 없음) (HCoV-HKU1)
    • 심한 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 (SARS-CoV)
    • 중동 호흡기 증후군 코로나 바이러스 (MERS-CoV)
    
    
  • 감마
    
    • 감염성 기관지염 바이러스 (IBV)
    • 터키 코로나 바이러스 (블루 콤병 바이러스)
    • 꿩 코로나 바이러스
    • 기니 닭 코로나 바이러스
    
    
  • 델타
    
    • 부벌 코로나 바이러스 (BuCoV)
    • 아구창 코로나 바이러스 (ThCoV)
    • 무 니아 코로나 바이러스 (MuCoV)
    • 돼지 코로나 바이러스 (PorCov) HKU15

본 발명의 코로나 바이러스의 변이 복제 유전자는 알파 코로나 바이러스, 예컨대 TGEV; 베타 코로나 바이러스, 예컨대 MHV; 또는 IBV와 같은 감마 코로나 바이러스 .
본원에서 사용 된 용어 "유래 된"은 복제 유전자가 관련 코로나 바이러스의 야생형 복제 유전자와 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다는 것을 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 변이 복제 유전자는 야생형 복제 서열과 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % 또는 99 %까지 동일성을 가질 수있다. 변이 코로나 바이러스 복제 유전자는 비 구조 단백질의 야생형 서열과 비교할 때 하나 이상의 비 구조 단백질 (nsp) -10, nsp-14, nsp-15 또는 nsp-16에 돌연변이를 포함하는 단백질을 암호화한다 단백질.
IBV
조류 전염성 기관지염 (IB)은 닭의 급성 및 전염성 호흡기 질환으로 상당한 경제적 손실을 초래합니다. 이 질병은 헐떡 거림, 기침, 재채기, 기관, 및 비강을 포함한 호흡기 증상을 특징으로합니다. 어린 닭에서는 심한 호흡 곤란이 발생할 수 있습니다. 층에서는 호흡 곤란, 신염, 난 생산 감소 및 내부 난 품질 손실 및 난각 품질이 일반적입니다.
육계에서 기침과 딸랑이는 일반적인 임상 증상으로 모든 건물의 조류에 빠르게 퍼집니다. 예방 접종을하지 않은 양떼의 이환율은 100 %입니다. 사망률은 연령, 바이러스 균주 및 2 차 감염에 따라 다르지만 예방 접종을하지 않은 양떼의 경우 최대 60 %가 될 수 있습니다.
확인 된 첫 번째 IBV 혈청 형은 매사추세츠 (Massachusetts) 였지만, 미국에서는 아칸소 (Arkansas)와 델라웨어 (Delaware)를 비롯한 여러 혈청 형이 원래 식별 된 매사추세츠 유형 외에 현재 순환하고 있습니다.
IBV 균주 Beaudette는 병아리 배아에서 적어도 150 계대를 따라 파생되었습니다. IBV Beaudette는 더 이상 부화 한 닭에게 병원성이 아니라 배아를 빠르게 죽입니다.
H120은 상업적 생 약독 화 IBV 매사추세츠 혈청 형 백신 균주이며, 발육 된 닭고기 달걀에서 약 120 계대에 의해 약독 화됩니다. H52는 또 다른 매사추세츠 백신이며, H120의 발달 과정에서 초기에 약간 더 병원성 계대 바이러스 (통로 52)를 나타냅니다. H120 기반 백신이 일반적으로 사용됩니다.
IB QX는 IBV의 악성 필드 분리입니다. 1990 년대 중반 중국의 칭다오 지역에서 질병이 발생한 후 원래 격리 되었기 때문에“중국어 QX”라고도합니다. 그 이후로 바이러스는 유럽으로 향했습니다. 2004 년부터 네덜란드에서 주로 서유럽 일부 지역에서 심각한 계란 생산 문제가 매우 유사한 바이러스로 확인되었지만 독일, 프랑스, 벨기에, 덴마크 및 영국에서도보고되었습니다.
네덜란드 사건에서 분리 된 바이러스는 Deventer의 Dutch Research Institute에 의해 D388이라는 새로운 계통으로 확인되었습니다. 중국의 연결은 바이러스가 중국 QX 바이러스와 99 % 유사하다는 추가 테스트를 통해 얻은 것입니다. 약독 화 생 QX 유사 IBV 백신 균주가 개발되었습니다.
IBV는 세포질 내에서 복제되고 비 분절, 단일 가닥, 양성 센스 RNA 게놈을 함유하는 외피 바이러스이다. IBV는 27.6 kb RNA 게놈을 가지며 모든 코로나 바이러스와 마찬가지로 4 개의 구조 단백질을 함유합니다. 게놈 RNA와 상호 작용하는 스파이크 당 단백질 (S), 작은 막 단백질 (E), 일체형 막 단백질 (M) 및 뉴 클레오 캡시드 단백질 (N).
게놈은 다음과 같은 방식으로 구성된다 : 5'UTR- 폴리머 라제 (복제) 유전자-구조 단백질 유전자 (SEMN) -UTR 3 '; 여기서 UTR은 번역되지 않은 영역 (IBV에서 각각 ~ 500 개의 뉴클레오티드)이다.
지질 외피는 3 개의 막 단백질 : S, M 및 E를 함유한다. IBV S 단백질은 소포체에서 올리고머 화되고 막 횡단 도메인을 통해 비리 온 막에 삽입 된 동종 삼량 체로 조립되고 비공유를 통해 결합되는 I 형 당 단백질이다 M 단백질과의 상호 작용. 코로나 바이러스 입자에 혼입 된 후, S 단백질은 표적 세포 수용체에 결합하고 바이러스 및 세포막의 융합을 담당한다. S 당 단백질은 4 가지 도메인, 즉 합성 동안 절단되는 신호 서열; 비리 온 입자의 외부에 존재하는 엑토 도메인; S 단백질을 비리 온 입자의 지질 이중층에 고정시키는 역할을하는 막 관통 영역; 및 세포질 꼬리.
모든 코로나 바이러스는 또한 시험 관내 복제에 필요하지 않지만, 발병에서 역할을 할 수있는 알려지지 않은 기능의 보조 단백질 유전자 세트를 암호화한다. IBV는 2 개의 보조 유전자, 유전자 3 및 5를 인코딩하고, 이들은 2 개의 보조 단백질 3a, 3b 및 5a, 5b를 각각 발현한다.
본 발명의 코로나 바이러스의 변이 복제 유전자는 IBV로부터 유래 될 수있다. 예를 들어, IBV는 IBV Beaudette, H120, H52, IB QX, D388 또는 M41 일 수 있습니다.
IBV는 IBV M41 일 수있다. M41은 1941 년 미국에서 분리 된 프로토 타입 매사추세츠 혈청 형입니다. 전 세계의 많은 실험실에서 병원성 실험실 얼룩으로 사용되는 분리 물이며 ATCC (VR-21 ™)에서 얻을 수 있습니다. 약독 화 된 변이체는 또한 여러 백신 생산 업체에 의해 매사추세츠 혈청 형에 대한 IBV 백신으로 사용되어 현장에서 문제를 일으 킵니다. 본 발명자들은이 바이러스에 대해 수년 동안 작용 한 바와 같이 완전한 바이러스 게놈의 서열이 이용 가능하기 때문에이 균주를 사용하기로 선택 하였다. 본 발명자들에 의해 사용 된 M41 단리 물, M41-CK는 일차 병아리 신장 (CK) 세포에서 자라도록 적응되었으므로 완전한 게놈의 cDNA로부터 감염성 바이러스로서 회복 될 수있는 것으로 간주되었다.
IBV M41-CK의 게놈 서열은 서열 번호 1로 제공된다.

IBV M41-CK 시퀀스 서열 번호 : 1 ACTTAAGATAGATATTAATATATATCTATCACACTAGCCTTGCGCTAGAT TTCCAACTTA ACAAAACGGACTTAAATACCTACAGCTGGTCCTCATAGGTGTTCCATTGC AGTGCACTTT AGTGCCCTGGATGGCACCTGGCCACCTGTCAGGTTTTTGTTATTAAAATC TTATTGTTGC TGGTATCACTGCTTGTTTTGCCGTGTCTCACTTTATACATCCGTTGCTTG GGCTACCTAG TATCCAGCGTCCTACGGGCGCCGTGGCTGGTTCGAGTGCGAAGAACCTCT GGTTCATCTA GCGGTAGGCGGGTGTGTGGAAGTAGCACTTCAGACGTACCGGTTCTGTTG TGTGAAATAC GGGGTCACCTCCCCCCACATACCTCTAAGGGCTTTTGAGCCTAGCGTTGG GCTACGTTCT CGCATAAGGTCGGCTATACGACGTTTGTAGGGGGTAGTGCCAAACAACCC CTGAGGTGAC AGGTTCTGGTGGTGTTTAGTGAGCAGACATACAATAGACAGTGACAACAT GGCTTCAAGC CTAAAACAGGGAGTATCTGCGAAACTAAGGGATGTCATTGTTGTATCCAA AGAGATTGCT GAACAACTTTGTGACGCTTTGTTTTTCTATACGTCACACAACCCTAAGGA TTACGCTGAT GCTTTTGCAGTTAGGCAGAAGTTTGATCGTAATCTGCAGACTGGGAAACA GTTCAAATTT GAAACTGTGTGTGGTCTCTTCCTCTTGAAGGGAGTTGACAAAATAACACC TGGCGTCCCA GCAAAAGTCTTAAAAGCCACTTCTAAGTTGGCAGATTTAGAAGACATCTT TGGTGTCTCTT CCCTTTGCAAGAAAATATCGTGAACTTTTGAAGACAGCATGCCAGTGGTC TCTTACTGTA 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복제
코로나 바이러스 게놈의 3 분의 2는 구조적 및 보조 유전자 이외에도 복제 유전자 (게놈의 5 '말단)를 포함하며, 이는 2 개의 다 단백질 인 pp1a 및 pp1ab로 표현되며, 여기서 pp1ab는 -1 리보솜 전환 메커니즘의 결과로서의 pp1a. 2 개의 폴리 단백질은 2 가지 유형의 바이러스-코딩 된 단백질 분해 효소에 의해 절단되어 보통 16 개의 비 구조 단백질 (Nsp1-16)을 생성하고; IBV에는 Nsp1이 없으므로 Nsp2-16을 인코딩합니다.
따라서, IBV의 유전자 1은 RNA 복제 및 전사와 관련된 15 (다른 코로나 바이러스에서 16) 비 구조 단백질 (nsp2-16)을 암호화한다.
용어 "복제 단백질"은 본원에서 pp1a 및 pp1ab 폴리 단백질 또는 개별 nsp 서브 유닛을 지칭하기 위해 사용된다.
용어 "복제 유전자"는 본원에서 복제 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 지칭하기 위해 사용된다.
코로나 바이러스 nsp 단백질의 기능 요약이 표 1에 제공되어있다.

1 번 테이블 Nsp 단백질 주요 특징들 1 코로나 바이러스 유전 내에서 보존되지만 여러 떼; 숙주 세포에서 잠재적 인 조절 기능. 2 MHV 및 SARS-CoV 복제에 필수 조직 배양 삼 산성 도메인; ADRP 및 폴리가있는 매크로 도메인 (ADP- 리보스)-결합 활성; 하나 또는 두 개의 ZBD- 파파인 유사 프로테아제를 함유하는 것; Y 도메인 4 막 관통 도메인 5 3C- 유사 주요 프로테아제, 동종이 량체 6 막 관통 도메인 7 nsp8과 상호 작용하여 hexadecamer complex를 형성 8 비 대포 RNA 폴리머 라제; nsp7과 상호 작용 16 진수를 형성하다 9 ssRNA- 결합 단백질, 이량 체 10 RNA- 결합 단백질, 호모도 데카 머, 아연-결합 nsp14 및 nsp16과 상호 작용하는 것으로 알려진 도메인 11 알 수 없는 12 RNA 의존적 RNA 중합 효소 13 아연 결합 도메인, NTPase, dNTPase, 5'-to-3 'RNA 및 DNA 헬리 카제, RNA 5'- 트리 포스페이트 14 3 '내지 5'엑소 리보 뉴 클레아 제, 아연-결합 도메인 및 N7- 메틸 트랜스퍼 라제 15 우릴 딜레이 트-특이 적 엔도 리보 뉴 클레아 제, 호모 헥사 머 16 추정 리보스 -2'-O- 메틸 트랜스퍼 라제

본 발명의 코로나 바이러스에 의해 암호화 된 변이 복제 유전자는 nsp-10, nsp-14, nsp-15 또는 nsp-16을 암호화하는 서열의 하나 이상의 섹션에서 돌연변이를 포함한다.
Nsp10은 RNA- 결합 활성을 가지며 pp1a / pp1ab 영역으로부터의 다른 nsp 내에서 동종 및 / 또는 이형 상호 작용에 관여하는 것으로 보인다. 5 개의 α- 헬릭스, 1 개의 10- 헬릭스 및 3 개의 β- 가닥으로 구성된 α / β 접기를 채택합니다 . 보존 된 시스테인 잔기 및 하나의 히스티딘 잔기 (Cys-74 / Cys-77 / His-83 / Cys-90; Cys-117 / Cys-120 / Cys-128 / Cys-)에 의해 형성된 2 개의 아연-결합 부위가 확인되었다. 130). 단백질은 명백한 특이성없이 단일 가닥 및 이중 가닥 RNA 및 DNA에 결합하는 것으로 확인되었다. Nsp-10은 nsp-9와 가교 결합 될 수 있으며, 이는 nsp-7, -8, -9 및 -10을 포함하는 단백질-단백질 상호 작용의 복잡한 네트워크가 존재 함을 시사한다. 또한 nsp-10은 nsp-14 및 nsp-16과 상호 작용하는 것으로 알려져 있습니다.
Nsp-14는 아미노-말단 영역에서 3'-to-5 '엑소 리보 뉴 클레아 제 (ExoN) 활성 도메인을 포함한다. SARS-CoV ExoN은 단일 가닥 및 이중 가닥 RNA 둘 다에 작용하지만 DNA에는 작용하지 않는 금속 이온-의존적 3'-to-5 '엑소 리보 뉴 클레아 제 활성을 갖는 것으로 입증되었다. Nsp-14는 교정 활동을하는 것으로 나타났습니다. 이 nsp는 또한 카르 복실-말단 영역에서 N7- 메틸 트랜스퍼 라제 (MT) 활성을 갖는 것으로 나타났다.
Nsp-15 관련 NendoU (U에 특이적인 니도 바이러스 엔도 리보 뉴 클레아 제) RNase 활성은 SARS-CoV, MHV 및 IBV를 포함한 여러 코로나 바이러스에 대해보고되었습니다. 활동은 지속적으로 Mn 2+ 이온에 의해 현저히 향상되는 것으로보고되었고 Mg 2+ 및 Ca 2+ 의 존재 하에서는 거의 활동이 없었다 . NendoU는 단일 가닥 및 이중 가닥 RNA 모두에서 우릴 레이트 잔기의 3 '측에서 절단된다. 코로나 바이러스 NendoU의 생물학적으로 관련된 기질 (들)은 여전히 확인되어야합니다.
Nsp-16은 리보스 -2'-O- 메틸 트랜스퍼 라제 (2'-O-MTase) 활성을 매개하는 것으로 예측되었고 역 유전학 실험은 2'-O-MTase 도메인이 HCoV-에서 바이러스 RNA 합성에 필수적이라는 것을 보여 주었다 229E 및 SARS-CoV. 효소는 코로나 바이러스 RNA의 캡 1 구조의 생산에 관여 할 수 있고, 다른 RNA 처리 경로에서 NendoU 및 ExoN 과도 협력 할 수있다. 2'-O-MTase는 또한 NendoU- 매개 절단으로부터 이들을 보호하기 위해 특이 적 RNA를 메틸화 할 수있다.
nsp-10, -14, -15 및 -16에 대한 게놈 및 단백질 서열은 각각 서열 번호 2-5 및 6-9로 제공된다.

(서열 번호 1의 nsp-10 뉴클레오티드 서열-뉴클레오티드 11884-12318) 서열 번호 : 2 TCTAAAGGTCATGAGACAGAGGAAGTGGATGCTGTAGGCATTCTCTCACT TTGTTCTTTTGCAGTA GATCCTGCGGATACATATTGTAAATATGTGGCAGCAGGTAATCAACCTTT AGGTAACTGTGTTAAA ATGTTGACAGTACATAATGGTAGTGGTTTTGCAATAACATCAAAGCCAAG TCCAACTCCGGATCAG GATTCTTATGGAGGAGCTTCTGTGTGTCTTTATTGTAGAGCACATATAGC ACACCTTGGCGGAGCA GGAAATTTAGATGGACGCTGTCAATTTAAAGGTTCTTTTGTGCAAATACC TACTACGGAGAAAGAT CCTGTTGGATTCTGTCTACGTAACAAGGTTTGCACTGTTTGTCAGTGTTG GATTGGTTATGGATGT CAGTGTGATTCACTTAGACAACCTAAACCTTCTGTTCAG (서열 번호 1의 nsp-14 뉴클레오티드 서열-뉴클레오티드 16938-18500) 서열 번호 : 3 GGTACAGGCTTGTTTAAAATTTGCAACAAAGAGTTTAGTGGTGTTCACCC AGCTTATGCAGTCACA ACTAAGGCTCTTGCTGCAACTTATAAAGTTAATGATGAACTTGCTGCACT TGTTAACGTGGAAGCT GGTTCAGAAATAACATATAAACATCTTATTTCTTTGTTAGGGTTTAAGAT GAGTGTTAATGTTGAA GGCTGCCACAACATGTTTATAACACGTGATGAGGCTATCCGCAACGTAAG AGGTTGGGTAGGTTTT GATGTAGAAGCAACACATGCTTGCGGTACTAACATTGGTACTAACCTGCC TTTCCAAGTAGGTTTC TCTACTGGTGCAGACTTTGTAGTTACGCCTGAGGGACTTGTAGATACTTC AATAGGCAATAATTTT 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NCNVDCYPDNSLVCRY DTRNLSVFNLPGCNGGSLYVNKHAFHTPKFDRTSFRNLKAMPFFFYDSSP CETIQLDGVAQDLVSL ATKDCITKCNICGAVCKKKAQMYADFVTSYNAAVTAGFTFWVTNNFNPYN LWKSFSALQ (NSP-15 아미노산 서열) 서열 번호 : 8 SIDNIAYNMYKGGHYDAIAGEMPTIVTGDKVFVIDQGVEKAVFFNQTILP TSVAFELYAKRNIRTL PNNRILKGLGVDVTNGFVIWDYTNQTPLYRNTVKVCAYTDIEPNGLIVLY DDRYGDYQSFLAADNA VLVSTQCYKRYSYVEIPSNLLVQNGIPLKDGANLYVYKRVNGAFVTLPNT LNTQGRSYETFEPRSD VERDFLDMSEESFVEKYGKELGLQHILYGEVDKPQLGGLHTVIGMCRLLR ANKLNAKSVTNSDSDV MQNYFVLADNGSYKQVCTVVDLLLDDFLELLRNILKEYGTNKSKVVTVSI DYHSINFMTWFEDGII KTCYPQLQ (NSP-16 아미노산 서열) 서열 번호 : 9 SAWTCGYNMPELYKVQNCVMEPCNIPNYGVGIALPSGIMMNVAKYTQLCQ YLSKTTMCVPHNMRVM HFGAGSDKGVAPGSTVLKQWLPEGTLLVDNDIVDYVSDAHVSVLSDCNKY KTEHKFDLVISDMYTD NDSKRKHEGVIANNGNDDVFIYLSSFLRNNLALGGSFAVKVTETSWHEVL YDIAQDCAWWTMFCTA VNASSSEAFLVGVNYLGASEKVIWSGKTLHANYIFWRNCNYLQTSAYSIF DVAKFDLRLKATPVVN LKTEQKTDLVFNLIKCGKLLVRDVGNTSFTSDSFVCTM

병원성 감소
본 발명의 생 약독 화 코로나 바이러스는 상응하는 야생형 유전자를 발현하는 코로나 바이러스에 비해 바이러스가 병원성을 감소시키는 변이 복제 유전자를 포함한다.
본원에 사용 된 용어 "감쇠 된"은 상기 감소 된 병원성을 나타내고 바이러스가 아닌 것으로 분류 될 수있는 바이러스를 지칭한다. 약독 화 생 바이러스는 면역 반응을 자극하고 면역력을 생성하지만 실제 질병을 유발하지는 않는 약화 된 복제 바이러스입니다.
용어 "병원성"은 대상체에서 질환을 유발할 수있는 바이러스의 잠재력을 지칭하는 그의 일반적인 의미에 따라 본원에서 사용된다. 전형적으로 코로나 바이러스의 병원성은 질병 관련 증상, 예를 들어 재채기, nick 음 및 기관 섬모 활동의 감소를 분석함으로써 결정된다.
용어 "감소 된 병원성"은 코로나 바이러스의 병원성 수준이 상응하는 야생형 코로나 바이러스에 비해 감소, 감소 또는 감소됨을 설명하는 데 사용된다.
일 구현 예에서, 본 발명의 코로나 바이러스는 그것이 유래 된 모 M41-CK 바이러스 또는 대조 코로나 바이러스와 비교하여 병원성이 감소된다. 대조군 코로나 바이러스는 공지 된 병원성을 갖는 코로나 바이러스, 예를 들어 야생형 복제 단백질을 발현하는 코로나 바이러스 일 수있다.
코로나 바이러스의 병원성은 당 업계에 공지 된 방법을 이용하여 평가 될 수있다. 전형적으로, 병원성 (pathogenicity)은 바이러스에 감염된 대상체, 예를 들어 닭에서 임상 증상을 분석함으로써 평가된다.
예를 들어, 닭은 코나 안구 접종으로 8-24 일령에 도전 할 수 있습니다. IBV 감염과 관련된 임상 증상은 감염 후 3-10 일에 평가 될 수 있습니다. 코로나 바이러스, 예를 들어 IBV의 병원성을 결정하기 위해 일반적으로 평가되는 임상 증상에는 가스 제거, 기침, 재채기, 질식, 우울증, 주름진 깃털 및 기관 섬모 활동의 상실이 포함됩니다.
코로나 바이러스로 발현 될 때 본 발명의 변이체 복제물은 야생형 복제물을 발현하는 코로나 바이러스와 비교하여 감소 된 수준의 임상 증상을 유발할 수있다.
예를 들어, 변이 복제물을 발현하는 코로나 바이러스는 분당 조류 당 90 % 미만, 80 % 미만, 70 % 미만, 60 % 미만, 50 % 미만, 40 % 미만의 다수의 스닉을 유발할 수 있으며, 야생형 복제물을 발현하는 바이러스에 의해 유발 된 스닉 수의 30 % 미만, 20 % 미만 또는 10 % 미만.
본 발명에 따른 변이 복제물을 발현하는 코로나 바이러스는 70 % 미만, 60 % 미만, 50 % 미만, 40 % 미만, 30 % 미만, 20 % 미만 또는 10 % 미만의 천명을 유발할 수있다. 야생형 복제물을 발현하는 바이러스에 감염된 무리의 조류 수.
본 발명에 따른 변이 복제물을 발현하는 코로나 바이러스는 기관 섬모 활성 수준의 60 % 이상, 70 % 이상, 80 % 이상, 90 % 이상 또는 95 % 이상인 기관 섬모 활성을 초래할 수있다 감염되지 않은 조류에서.
본 발명에 따른 변이 복제물을 발현하는 코로나 바이러스는 표 2에 정의 된 바와 같이 야생형 복제물을 발현하는 코로나 바이러스보다 낮은 수준에서 임상 증상을 유발할 수있다.

표 2 임상 징후에 따른 IBV 심각도 한계 :

코로나 바이러스로 발현 될 때, 본 발명의 변이체 복제물은 바이러스가 비병원성 수준으로 ovo에서 복제되게 할 수있다.
난소에서 닭 배아에 투여 될 백신을 개발하는 동안, 백신에 대한 모체 항체의 효과 및 배아에 대한 백신의 효과의 두 가지 점에주의를 기울여야한다. 모체 항체는 능동 면역을 방해하는 것으로 알려져있다. 예를 들어, 약한 균주를 가진 백신은 모계 항체 풀에 의해 중화되기 때문에 모계 항체를 갖는 육계 닭에 투여 될 때 보호 항체 수준을 유도하지 않는다.
따라서 바이러스 입자는 바이러스에 대한 모계 유래 항체에 의해 중화되지 않도록 복제 및 증식에 충분히 효율적이어야한다. 모계 유래 항체는 닭이 나이가 들어감에 따라 감소하는 유효 항체의 유한 풀이며, 이러한 방식으로 바이러스의 중화는 배아 / 병아에 대한 장기 면역의 확립과 동일하지 않다. 바이러스에 대한 장기 면역성을 개발하기 위해, 배아 및 부화 닭은 모계 유래 항체의 효과와 구별되는 적절한 보호 면역 반응을 개발해야합니다.
난소 예방 접종에 유용하기 위해 바이러스는 또한 배아에 병원성이되는 수준으로 복제 및 전파되어서는 안됩니다.
배아 측면에서 병원성이 감소한다는 것은 코로나 바이러스가 상응하는 야생형 대조군 코로나 바이러스에 비해 부화율의 감소를 덜 유발한다는 것을 의미 할 수있다. 따라서, 본 발명의 맥락에서 "배아에 병원성이없는"이라는 용어는 대조 코로나 바이러스와 비교할 때 "해치 감소를 유발하지 않는"을 의미 할 수있다.
적절한 변형 복제물은 당 업계에 공지 된 방법을 사용하여 식별 될 수있다. 예를 들어, 모계 유래 항체를 갖거나 갖지 않은 배아의 난소 백신 접종 후의 비교 챌린지 실험이 수행 될 수있다 (즉, 층이 IBV에 대해 백신 접종되거나 백신 접종되지 않은 경우).
변이 복제물이 바이러스가 너무 높은 수준으로 전파 될 수 있다면, 배아가 부화하지 않거나 부화 후에 생존 할 수 없게된다 (즉, 바이러스가 배아에 병원 성임). 배아에 병원 성인 바이러스는 배아를 죽일 수 있습니다.
변이체 복제물이 바이러스 복제 및 증식의 감소를 유발하는 경우, 바이러스는 모계 유래 항체에 의해 중화 될 것이다. 따라서 IBV에 의한 병아리의 후속 도전은 임상 증상 (예를 들어 천명, s 음, 섬모 활동의 상실) 및 도전 된 병아리에서의 질병의 발병을 초래할 것이다; 바이러스에 대한 효과적인 면역력을 개발하지 못했을 것입니다.
다른
본원에 사용 된 용어 "변이체"는 "돌연변이 체"와 동의어이며 상응하는 야생형 서열과 비교하여 상이한 핵산 또는 아미노산 서열을 지칭한다.
변이체 / 돌연변이 서열은 자연적으로 발생하거나 인공적으로 생성 될 수있다 (예를 들어, 부위-지정 돌연변이 유발에 의해). 돌연변이 체는 야생형 서열의 상응하는 부분과 70, 80, 90, 95, 98 또는 99 % 이상의 서열 동일성을 가질 수있다. 돌연변이 체는 야생형 서열의 상응하는 부분에 걸쳐 20, 10, 5, 4, 3, 2 또는 1 개 미만의 돌연변이 (들)를 가질 수있다.
용어 "야생형"은 각각 고유 유전자 또는 단백질과 동일한 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열을 갖는 유전자 또는 단백질 (즉, 바이러스 유전자 또는 단백질)을 의미하는 데 사용된다.
동일성 비교는 눈으로 또는보다 일반적으로 쉽게 이용 가능한 서열 비교 프로그램의 도움으로 수행 될 수있다. 이러한 상업적으로 이용 가능한 컴퓨터 프로그램은 둘 이상의 서열 사이의 % 동일성을 계산할 수있다. 이러한 정렬을 수행하기에 적합한 컴퓨터 프로그램은 GCG Wisconsin Bestfit 패키지이다 (University of Wisconsin, USA; Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12 : 387). 서열 비교를 수행 할 수있는 다른 소프트웨어의 예는 BLAST 패키지 (Ausubel et al., 1999 ibid-Chapter 18 참조), FASTA (Atschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 403-410) 및 GENEWORKS 제품군의 비교 도구 인 ClustalX (Larkin et al. (2007) Clustal W 및 Clustal X 버전 2.0. Bioinformatics, 23 : 2947-2948 참조). BLAST와 FASTA는 모두 오프라인 및 온라인 검색에 사용할 수 있습니다 (Ausubel et al., 1999 ibid, 7-58 ~ 7-60 페이지 참조). 그러나 일부 응용 프로그램의 경우 GCG Bestf it 프로그램을 사용하는 것이 좋습니다. BLAST 2 Sequences라는 새로운 도구를 사용하여 단백질과 뉴클레오티드 서열을 비교할 수도 있습니다 (FEMS Microbiol Lett 1999 174 (2) : 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177 (1) : 187-8 및 tatiana@ncbi.nlm 참조). .nih.gov).
서열은 하나 이상의 결실, 삽입 또는 아미노산 잔기의 치환을 가질 수 있으며, 이는 침묵 변화를 생성하고 기능적으로 동등한 분자를 생성한다. 의도적 인 아미노산 치환은 활성이 유지되는 한 잔류 물의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및 / 또는 양친 매성 성질의 유사성에 기초하여 이루어질 수있다. 예를 들어, 음으로 하전 된 아미노산은 아스파르트 산 및 글루탐산; 양으로 하전 된 아미노산은 리신 및 아르기닌을 포함하고; 유사한 친수성 값을 갖는 하전되지 않은 극성 헤드 그룹을 갖는 아미노산은 류신, 이소류신, 발린, 글리신, 알라닌, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 페닐알라닌 및 티로신을 포함한다.
보존 적 치환은 예를 들어하기 표에 따라 이루어질 수있다. 두 번째 컬럼에서 동일한 블록에 있고 바람직하게는 세 번째 컬럼에서 동일한 라인에있는 아미노산은 서로 대체 될 수 있습니다.

ALIPHATIC 비극성 G A P 나는 L V 비 충전 C S T M N Q 극 전하 D E K R 향긋한 H F W Y

본 발명의 코로나 바이러스는 코로나 바이러스에서 발현 될 때 바이러스를 감소시키는 서열 번호 6, 7, 8 또는 9 중 어느 하나와 비교하여 돌연변이를 포함하는 단백질을 암호화하는 변이 복제 유전자를 포함 할 수있다. 상응하는 야생형 복제물을 발현하는 코로나 바이러스와 비교 한 병원성.
변이 복제 유전자는 nsp-10, nsp-14, nsp-15 및 nsp-16의 임의의 조합으로 적어도 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함하는 단백질을 암호화 할 수있다.
본 발명의 코로나 바이러스의 변이 복제 유전자는 M41 모드 서열에 정의 된 돌연변이를 포함하는 단백질을 암호화 할 수있다. 무화과. 10.
본 발명의 코로나 바이러스의 변이 복제 유전자는하기 목록에서 선택된 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함하는 단백질을 암호화 할 수있다 :

• 
  
  • 서열 번호 : 6의 위치 85에서 Leu로 프로,
  • 서열 번호 : 7의 위치 393에서 Val 내지 Leu;
  • 서열 번호 : 8의 위치 183에서 Leu 내지 Ile;
  • 서열 번호 : 9의 위치 209에서 Val까지

본 발명의 코로나 바이러스의 변이 복제 유전자는 nsp-2, nsp-3, nsp-6 또는 nsp-13에서 돌연변이를 포함하지 않는 단백질을 암호화 할 수있다.
본 발명의 코로나 바이러스의 변이 복제 유전자는 Ammayappan 등에 의해보고 된 유전자에서 뉴클레오티드 위치 12,008에서의 돌연변이에 의해 야기 된 트레오닌 대 이소류신 돌연변이에 상응하는 nsp10의 돌연변이를 포함하지 않는 단백질을 암호화 할 수있다. (Arch Virol (2009) 154 : 495-499).
Ammayappan 등 (상기)은 IBV 균주 아칸소 DPI의 감쇠를 담당하는 서열 변화의 확인을보고한다. 이 연구는 다중 계대에 따라 다양한 IBV 단백질에서 17 개의 아미노산 변화가 확인되었다. 배아 알에 바이러스의 100. 약독 화 된 바이러스 (Ark DPI 101)가 배아에 병원성없이 ovo의 바이러스에 대해 모계 유래 항체의 존재하에 복제 할 수 있는지 여부는 조사되지 않았다. 이 바이러스가 기존 IBV 백신과 유사한 방법론 인 SPF 배아 알에서 다중 계대에 의해 생성되었다는 것을 감안할 때,이 바이러스는 배아에 병원성 일 가능성이 있습니다. 암탉이 유사한 혈청 형으로 백신 접종을받은 경우에도 바이러스는 모계 유래 항체에 민감 할 수 있습니다.
본 발명의 코로나 바이러스의 변이 복제 유전자는 상기 목록에 제공된 하나 이상의 아미노산 돌연변이의 임의의 조합을 포함하는 단백질을 암호화 할 수있다.
변이 복제 유전자는 서열 번호 6의 위치 85에서 Leu에 아미노산 돌연변이 Pro를 포함하는 단백질을 암호화 할 수있다.
변이 복제 유전자는 서열 번호 7의 위치 393에서 아미노산 돌연변이 Val to Leu를 포함하는 단백질을 암호화 할 수있다.
변이 복제 유전자는 서열 번호 8의 위치 183에서 아미노산 돌연변이 Leu to Ile을 포함하는 단백질을 암호화 할 수있다.
변이 복제 유전자는 서열 번호 9의 위치 209에서 아미노산 돌연변이 Val to Ile을 포함하는 단백질을 암호화 할 수있다.
변이체 복제 유전자는 서열 번호 : 6의 위치 85에서 아미노산에 대해 Pro to Leu, 및 서열 번호 : 7의 위치 393에서 Val to Leu를 포함하는 단백질을 암호화 할 수있다.
변이체 복제 유전자는 서열 번호 : 6의 위치 85에서 아미노산에 대한 아미노산 돌연변이 Pro 내지 Leu를 서열 번호 : 8의 위치 183에서 Leu 내지 Ile로 포함하는 단백질을 암호화 할 수있다.
변이체 복제 유전자는 서열 번호 6의 위치 85에서 아미노산 서열 Pro to Leu 및 서열 번호 : 9의 위치 209에서 Val to Ile을 포함하는 단백질을 암호화 할 수있다.
변이체 복제 유전자는 서열 번호 : 7의 위치 393에서 아미노산 돌연변이 Val 내지 Leu 및 서열 번호 : 8의 위치 183에서 Leu to Ile을 포함하는 단백질을 암호화 할 수있다.
변이 복제 유전자는 서열 번호 : 7의 393 번 위치에서 Val to Leu 및 서열 번호 : 9의 209 번 위치에서 Val to Lele 아미노산 돌연변이를 포함하는 단백질을 암호화 할 수있다.
변이 복제 유전자는 서열 번호 8의 183 번 위치에서 아미노산 돌연변이 Leu에서 Ile로, 서열 번호 9의 209 번 위치에서 Val to Ile로 구성되는 단백질을 암호화 할 수있다.
변이체 복제 유전자는 서열 번호 6의 위치 85에서 아미노산 서열 Pro to Leu, 서열 번호 : 7의 위치 393에서 Val to Leu 및 서열 번호 No. 183의 Leu to Ile을 포함하는 단백질을 암호화 할 수있다. : 8.
변이체 복제 유전자는 서열 번호 : 6의 85 위치에서 아미노산에 대한 Proto Leu의 아미노산 서열을 서열 번호 : 8의 위치 183에서 Leu 내지 Ile, 서열 번호 : 209의 Val에서 Ile로 구성하는 단백질을 암호화 할 수있다. 9.
변이체 복제 유전자는 서열 번호 6의 위치 85에서 아미노산 서열 Pro to Leu, 서열 번호 : 7의 위치 393에서 Val to Leu 및 서열 번호 NO의 209 위치에서 Val to Ile을 포함하는 단백질을 암호화 할 수있다. : 9.
변이체 복제 유전자는 서열 번호 : 7의 393 번 위치에서 아미노산에 대한 Val to Leu, 서열 번호 : 8의 183 위치에서 Leu 내지 Ile, 서열 번호 : 209의 Val에 Ile을 포함하는 단백질을 암호화 할 수있다. : 9.
변이체 복제 유전자는 서열 번호 6의 위치 85에서 아미노산 서열 Pro to Leu, 서열 번호 7의 위치 393에서 Val to Leu, 서열 번호 : 183의 Leu 내지 Ile을 포함하는 단백질을 암호화 할 수있다. : 서열 번호 9의 위치 209에서 8과 Val to Ile.
변이체 복제 유전자는 또한 뉴클레오티드 수준에서 정의 될 수있다.
예를 들어, 본 발명의 코로나 바이러스의 변이 복제 유전자의 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID의 11884-12318, 16938-18500, 18501-19514 및 19515-20423의 목록에서 선택된 영역 내에 하나 이상의 뉴클레오티드 치환을 포함 할 수있다. ID NO : 1.
예를 들어, 본 발명의 코로나 바이러스의 변이 복제 유전자의 뉴클레오티드 서열은하기 목록으로부터 선택된 하나 이상의 뉴클레오티드 치환을 포함 할 수있다 :

• 
  
  • C 내지 Tat 뉴클레오티드 위치 12137;
  • 뉴클레오티드 위치 18114에서 G 내지 C;
  • 뉴클레오티드 위치 19047에서 T가 A로; 과
  • 뉴클레오티드 위치 20139에서 G 내지 A;
    서열 번호 1로 나타낸 서열과 비교.

본원에 사용 된 용어 "치환"은 용어 돌연변이와 동의어이며, 확인 된 위치의 뉴클레오티드가 야생형 뉴클레오티드 서열의 것과 다르다는 것을 의미한다.
뉴클레오티드 서열은하기 목록에서 선택된 뉴클레오티드 치환의 임의의 조합을 포함 할 수있다 :

• 
  
  • C 내지 Tat 뉴클레오티드 위치 12137;
  • G 내지 Cat 뉴클레오티드 위치 18114;
  • 뉴클레오티드 위치 19047에서 T가 A로; 과
  • 뉴클레오티드 위치 20139에서 G 내지 A;
    서열 번호 1로 나타낸 서열과 비교.

뉴클레오티드 서열은 치환 C12137T를 포함 할 수있다.
뉴클레오티드 서열은 치환 G18114C를 포함 할 수있다.
뉴클레오티드 서열은 치환 T19047A를 포함 할 수있다.
뉴클레오티드 서열은 치환 G20139A를 포함 할 수있다.
뉴클레오티드 서열은 치환 C12137T 및 G18114C를 포함 할 수있다.
뉴클레오티드 서열은 치환 C12137T 및 T19047A를 포함 할 수있다.
뉴클레오티드 서열은 치환 C12137T 및 G20139A를 포함 할 수있다.
뉴클레오티드 서열은 치환 G18114C 및 T19047A를 포함 할 수있다.
뉴클레오티드 서열은 치환 G18114C 및 G20139A를 포함 할 수있다.
뉴클레오티드 서열은 치환 T19047A 및 G20139A를 포함 할 수있다.
뉴클레오티드 서열은 치환 C12137T, G18114C 및 T19047A를 포함 할 수있다.
뉴클레오티드 서열은 치환 C12137T, T19047A 및 G20139A를 포함 할 수있다.
뉴클레오티드 서열은 치환 C12137T, G18114C 및 G20139A를 포함 할 수있다.
뉴클레오티드 서열은 치환 G18114C, T19047A 및 G20139A를 포함 할 수있다.
뉴클레오티드 서열은 치환 C12137T, G18114C, T19047A 및 G20139A를 포함 할 수있다.
뉴클레오티드 서열은 Ammayappan 등에 의해보고 된 C12008T 치환에 상응하는 치환을 포함하지 않을 수있다. (위와 같이).
뉴클레오티드 서열은 천연, 합성 또는 재조합 일 수있다. 이중 또는 단일 가닥 일 수 있으며, DNA 또는 RNA 또는 이들의 조합 일 수있다. 예를 들어, cDNA, PCR 산물, 게놈 서열 또는 mRNA 일 수있다.
뉴클레오티드 서열은 선택된 숙주 / 호스트 세포에서의 생산을 위해 코돈 최적화 될 수있다.
단리되거나 플라스미드, 바이러스 또는 숙주 세포의 일부로 분리 될 수 있습니다.
플라스미드
플라스미드는 염색체 DNA와 독립적으로 복제 할 수있는 염색체 DNA와 분리 된 염색체 외 DNA 분자입니다. 그들은 일반적으로 원형 및 이중 가닥입니다.
플라스미드 또는 벡터 (때때로 알려진 바와 같이)는 숙주 세포에서 단백질을 발현시키기 위해 사용될 수있다. 예를 들어, 박테리아 숙주 세포는 그 단백질을 발현시키기 위해 특정 단백질을 인코딩 할 수있는 플라스미드로 형질 감염 될 수있다. 상기 용어는 또한 더 긴 부분의 DNA를 수용 할 수있는 효모 인공 염색체 및 박테리아 인공 염색체를 포함한다.
본 발명의 플라스미드는 복제 단백질의 정의 된 영역을 암호화 할 수있는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또한 하나 이상의 추가 코로나 바이러스 뉴클레오티드 서열 (들), 또는 하나 이상의 다른 코로나 바이러스 단백질, 예컨대 S 유전자 및 / 또는 유전자 3을 암호화 할 수있는 뉴클레오티드 서열 (들)을 포함 할 수있다.
플라스미드는 또한 에스 케리 키아 콜라이 (Escherichia coli )로부터의 구아닌 크 산틴 포스 포리보실 트랜스퍼 라제 유전자 (gpt)와 같은 저항성 마커를 포함 할 수 있으며 , 이는 크 산틴 및 하이포크 산틴의 존재하에 미코 페놀 산 (MPA)에 대한 내성을 부여하며, 백시 니아 바이러스 P7.5에 의해 조기에 제어된다 / late promoter.
재조합 백시 니아 바이러스
본 발명은 또한 본원에 정의 된 변이 복제 유전자를 포함하는 재조합 백시 니아 바이러스 (rVV)에 관한 것이다.
재조합 백시 니아 바이러스 (rVV)는 백시 니아 바이러스 기반 역 유전학 시스템을 사용하여 제조 될 수있다.
이와 관련하여, 본 발명은 또한 다음에 의해 바이러스 입자를 제조하는 방법을 제공한다 :

• 
  
  • (i) 이전 섹션에서 설명 된 플라스미드를 숙주 세포로 형질 감염시키는 단계;
  • (ii) 복제 세포로 코로나 바이러스 균주의 게놈을 포함하는 재조합 바이러스로 숙주 세포를 감염시키는 단계;
  • (iii) 플라스미드의 복제 유전자 서열과 재조합 바이러스 게놈의 상응하는 서열 사이에 상동 재조합이 일어나 변형 된 복제 유전자를 생성하는 단계;
  • (iv) 변형 된 복제 유전자를 포함하는 재조합 바이러스를 선별하는 단계.

용어 "변형 된 복제 유전자"는 본 발명의 제 1 측면과 관련하여 기재된 바와 같은 변이 복제 유전자를 포함하는 복제 유전자를 의미한다. 구체적으로, 상기 용어는 야생형 복제 유전자로부터 유래되지만 본원에 정의 된 변이 복제 단백질을 암호화하게하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자를 의미한다.
재조합은 복제 유전자의 전부 또는 일부를 포함 할 수있다. 예를 들어, 재조합은 nsp-10, nsp-14, nsp-15 및 / 또는 nsp-16의 임의의 조합을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함 할 수있다. 재조합은 아미노산 돌연변이를 암호화하거나 상기 정의 된 바와 같은 뉴클레오티드 치환을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함 할 수있다.
코로나 바이러스 균주의 게놈은 플라스미드에 의해 제공된 부분에 상응하는 복제 단백질의 일부가 결여 될 수있어서, 플라스미드에 의해 제공된 뉴클레오티드 서열의 삽입을 통해 변형 된 단백질이 형성된다.
재조합 바이러스는 그의 게놈과 플라스미드 사이의 상동 재조합을 허용하기에 적합한 것이다. 백시 니아 바이러스는 백시 니아 바이러스 게놈에 대한 서열을 삽입하고 결실시키기 위해 상동 재조합이 일상적으로 사용되므로 특히 적합하다.
위의 방법에는 선택적으로 단계가 포함됩니다.

• 
  
  • (v) 단계 (iv)의 재조합 바이러스로부터 DNA로부터의 변형 된 복제 유전자를 포함하는 재조합 코로나 바이러스의 회수.

재조합 IBV와 같은 재조합 코로나 바이러스를 회수하는 방법은 당 업계에 공지되어있다 (Britton et al (2005) 참조 24 페이지 및 PCT / GB2010 / 001293).
예를 들어, 단계 (iv)의 재조합 바이러스로부터의 DNA는 플라스미드에 삽입되어 세포질 T7 RNA 폴리머 라제를 발현하는 세포를 형질 감염시키는 데 사용될 수있다. 세포는 예를 들어 T7 RNA 폴리머 라제를 발현하는 가두 바이러스로 사전 감염 될 수있다. 이어서 재조합 코로나 바이러스는 예를 들어 성장 배지로부터 단리 될 수있다.
플라스미드가 백시 니아 바이러스 게놈 내로 삽입 될 때, 불안정한 중간체가 형성된다. 플라스미드를 포함하는 재조합 체는 예를 들어 플라스미드상의 저항 마커를 사용하여 선택 될 수있다.
이어서, 양성 재조합 체는 예를 들어 PCR 및 서열 분석에 의해 변형 된 복제 유전자를 함유하는 것으로 확인 될 수있다.
변형 된 복제 유전자 (예를 들어, 재조합 백시 니아 바이러스 (rVV))를 포함하는 재조합 바이러스의 큰 스톡을 성장시키고 단계 (v)를 수행하기 위해 DNA를 추출 할 수있다.
적합한 역 유전학 시스템은 당 업계에 공지되어있다 (Casais et al (2001) J. Virol 75 : 12359-12369; Casais et al (2003) J. Virol. 77 : 9084-9089; Britton et al (2005) J. Virological 방법 123 : 203-211; Armesto et al (2008) Methods in Molecular Biology 454 : 255-273).
세포
코로나 바이러스는 세포를 감염시키는 데 사용될 수 있습니다.
코로나 바이러스 입자는 당 업계에 공지 된 방법에 의해, 예를 들어 상청액으로부터 수확되고, 임의로 정제 될 수있다.
세포는 코로나 바이러스 입자를 생성하는데 사용될 수있다.
따라서, 본 발명은 또한 다음 단계를 포함하는 코로나 바이러스의 제조 방법을 제공한다 :
(i) 본 발명에 따른 코로나 바이러스로 세포의 감염;
(ii) 바이러스가 세포에서 복제되도록하는 단계; 과
(iii) 자손 바이러스를 수확하는 단계.
본 발명은 또한 역 유전학 시스템을 사용하여 본 발명에 따른 코로나 바이러스를 생산할 수있는 세포를 제공한다. 예를 들어, 세포는 본 발명의 복제 유전자를 암호화 할 수있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 바이러스 게놈을 포함 할 수있다.
세포는 복제 유전자를 함유하는 재조합 재조합 바이러스 (예를 들어 백시 니아 바이러스)를 생산할 수있다.
대안 적으로, 세포는 역 유전학 시스템에 의해 재조합 코로나 바이러스를 생산할 수있다. 세포는 재조합 바이러스 입자를 구제하기 위해 T7 폴리머 라제를 발현 시키거나 발현 시키도록 유도 될 수있다.
백신
코로나 바이러스는 백신을 생산하는데 사용될 수있다. 백신은 본 발명의 코로나 바이러스의 약독 화 형태에 의해 약학 적으로 허용되는 담체를 추가로 포함 할 수있다. 본원에 정의 된 바와 같이, 본 발명에 사용하기에 적합한 "제약 상 허용되는 담체"는 당업자에게 널리 공지되어있다. 이러한 담체는 물, 식염수, 완충 식염수, 포스페이트 완충제, 알코올 / 수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액을 제한없이 포함한다. 다른 통상적으로 사용되는 희석제 및 부형제가 통상적 인 기술에 따라 첨가 될 수있다. 이러한 담체는 에탄올, 폴리올 및 이들의 적합한 혼합물, 식물성 오일 및 주사 가능한 유기 에스테르를 포함 할 수있다. 완충제 및 pH 조절 제가 또한 사용될 수있다. 완충제는 유기산 또는 염기로부터 제조 된 염을 제한없이 포함한다. 대표적인 완충제는 유기산 염, 예컨대 시트르산의 염, 예를 들어 시트 레이트, 아스코르브 산, 글루 콘산, 히스티딘-헬, 탄산, 타르타르산, 숙신산, 아세트산 또는 프탈산, 아이리스, 트리 에탄 민 히드로 클로라이드 또는 포스페이트 완충제. 비경 구 담체는 염화나트륨 용액, 링거 덱 스트로스, 덱 스트로스, 트레할로스, 수 크로스 및 염화나트륨, 수유 된 링거 또는 고정 유를 포함 할 수있다. 정맥 내 담체는 유체 및 영양 보충제, 링거 덱 스트로스 등에 기초한 것과 같은 전해질 보충제를 포함 할 수있다. 보존제 및 다른 첨가제, 예를 들어, 항균제, 항산화 제, 킬레이트 제 (예를 들어, EDTA), 불활성 가스 등이 또한 약학 적 담체에 제공 될 수있다. 본 발명은 캐리어의 선택에 의해 제한되지 않는다. 적절한 pH 등장 성, 안정성 및 다른 통상적 인 특성을 갖는 상기 기재된 성분으로부터 이들 제약 상 허용되는 조성물의 제조는 당업자의 기술 범위 내에있다. 예를 들어, Remington : The Science and Practice of Pharmacy, 20th ed, Lippincott Williams & Wilkins, pub!., 2000; 및 제약 부형제 핸드북, 제 4 편집, eds. RC Rowe 등, APhA Publications, 2003. Lippincott Williams & Wilkins, pub!., 2000; 및 제약 부형제 핸드북, 제 4 편집, eds. RC Rowe 등, APhA Publications, 2003. Lippincott Williams & Wilkins, pub!., 2000; 및 제약 부형제 핸드북, 제 4 편집, eds. RC Rowe 등, APhA Publications, 2003.
본 발명의 백신은 "치료 적 유효량"으로 투여 될 것이며, 이는 대상 또는 환자에게 투여 될 때 유익하거나 바람직한 결과를 달성하기에 충분한 양의 활성 성분, 예를 들어 본 발명에 따른 작용제를 지칭한다. 유효량은 하나 이상의 투여, 적용 또는 투여 량으로 투여 될 수있다. 본 발명에 따른 조성물의 치료 유효량은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수있다. 본 발명의 맥락에서, "치료 적 유효량"은 유익하거나 바람직한 결과를 달성하기에 충분한 감염성 기관지염 상태와 관련된 하나 이상의 파라미터에서 객관적으로 측정 된 변화를 생성하는 것이다. 유효량은 하나 이상의 투여로 투여 될 수있다. 본 발명의 목적 상, 유효량의 약물, 화합물 또는 제약 조성물은 감염성 기관지염의 발생률을 감소시키기에 충분한 양이다. 본원에 사용 된 용어 "치료제"는 질환, 병태 또는 장애에 대한 치료의 전체 스펙트럼을 포함한다. 본 발명의 "치료제"는 위험에 처한 것으로 식별 될 수있는 동물을 표적으로하도록 고안된 절차를 포함하는 예방 적 또는 예방 적 방식으로 작용할 수 있으며 (약력학); 또는 본질적으로 개선 적이거나 치유적인 방식으로; 또는 치료되는 질환 또는 장애의 적어도 하나의 증상의 진행 속도 또는 정도를 늦추도록 작용할 수있다. 본원에 사용 된 용어 "치료제"는 질환, 병태 또는 장애에 대한 치료의 전체 스펙트럼을 포함한다. 본 발명의 "치료제"는 위험에 처한 것으로 식별 될 수있는 동물을 표적으로하도록 고안된 절차를 포함하는 예방 적 또는 예방 적 방식으로 작용할 수 있으며 (약력학); 또는 본질적으로 개선 적이거나 치유적인 방식으로; 또는 치료되는 질환 또는 장애의 적어도 하나의 증상의 진행 속도 또는 정도를 늦추도록 작용할 수있다. 본원에 사용 된 용어 "치료제"는 질환, 병태 또는 장애에 대한 치료의 전체 스펙트럼을 포함한다. 본 발명의 "치료제"는 위험에 처한 것으로 식별 될 수있는 동물을 표적으로하도록 고안된 절차를 포함하는 예방 적 또는 예방 적 방식으로 작용할 수 있으며 (약력학); 또는 본질적으로 개선 적이거나 치유적인 방식으로; 또는 치료되는 질환 또는 장애의 적어도 하나의 증상의 진행 속도 또는 정도를 늦추도록 작용할 수있다. 위험에 처한 것으로 식별 될 수있는 동물을 표적으로하도록 고안된 절차를 포함하는 절차를 포함한다 (약 유전학); 또는 본질적으로 개선 적이거나 치유적인 방식으로; 또는 치료되는 질환 또는 장애의 적어도 하나의 증상의 진행 속도 또는 정도를 늦추도록 작용할 수있다. 위험에 처한 것으로 식별 될 수있는 동물을 표적으로하도록 고안된 절차를 포함하는 절차를 포함한다 (약 유전학); 또는 본질적으로 개선 적이거나 치유적인 방식으로; 또는 치료되는 질환 또는 장애의 적어도 하나의 증상의 진행 속도 또는 정도를 늦추도록 작용할 수있다.
본 발명은 또한 본 발명의 제 1 측면과 관련하여 정의 된 바와 같은 복제 단백질을 포함하는 바이러스 입자로 세포, 예를 들어 베로 세포를 감염시키는 단계를 포함하는 백신의 제조 방법에 관한 것이다.
예방 접종 방법
본 발명의 코로나 바이러스는 질병을 치료 및 / 또는 예방하는데 사용될 수있다.
"치료하는"은 질병과 관련된 적어도 하나의 증상을 감소, 감소 또는 개선시키고 / 시키거나 질병의 진행을 늦추거나 감소 시키거나 차단하기 위해 기존 질병을 갖는 대상체에게 백신을 투여하는 것을 의미한다.
"예방하는"은 질병을 아직 수축시키지 않았거나 질병의 원인 (예 : 감염)을 예방 또는 손상시키기 위해 또는 질병의 증상을 나타내지 않는 대상체에게 백신을 투여하는 것을 의미한다 질병과 관련된 적어도 하나의 증상의.
질환은 인간의 호흡기 질환 및 / 또는 위장염 및 간염, 위장염, 뇌염 또는 다른 동물의 호흡기 질환과 같은 코로나 바이러스에 의해 야기 된 임의의 질환 일 수있다.
이 질병은 전염성 기관지염 (IB) 일 수 있습니다. 돼지 전염성 설사; 전염성 위장염; 마우스 간염 바이러스; 돼지 혈구 응집 뇌염; 심한 급성 호흡기 증후군 (SARS); 또는 블루 콤 질환.
이 질병은 전염성 기관지염 일 수 있습니다.
백신은 부화 병아리 또는 닭, 예를 들어 점안제 또는 비강 내 투여에 의해 투여 될 수있다. 비록 정확하지만, 이러한 방법은 예를 들어 대형 육계 양떼에 비싸다. 대안으로는 식수에 스프레이를 접종하는 것이 포함되지만 이러한 방법을 사용하여 균일 한 백신 적용을 보장하기는 어려울 수 있습니다.
백신은 안구 내 사용을위한 점안제와 같은 투여에 적합한 형태로 제공 될 수있다.
백신은 난소 접종, 예를 들어 배아 난의 주사에 의해 투여 될 수있다. 난소 백신 접종은 질병에 대한 초기 단계 저항성을 제공한다는 이점이있다. 또한 분무 접종 및 식수를 통한 투여와 달리, 피험자 당 균일 한 투여를 용이하게합니다.
백신은 알란 토닉 유체, 노른자 낭, 양막, 공기 세포 또는 배아를 포함하여 난의 임의의 적합한 구획에 투여 될 수있다. 그것은 껍질 (공기 세포) 막과 융모 막막 아래에 투여 될 수 있습니다.
일반적으로 백신은 배아 발달의 말기 단계 동안, 일반적으로 부화 전 3-4 일과 같은 배양 기간의 마지막 분기 동안 배아 알에 주사됩니다. 닭에서, 백신은 21 일 배양 기간의 15-19 일 사이, 예를 들어 17 일 또는 18 일에 투여 될 수있다.
프로세스는 WO 2004/078203에 기술 된 것과 같은 로봇 식 주입 프로세스를 사용하여 자동화 될 수있다.
백신은 하나 이상의 다른 백신, 예를 들어 뉴캐슬병 바이러스 (NDV)와 같은 다른 질병에 대한 백신과 함께 투여 될 수있다. 본 발명은 또한 하나 이상의 다른 백신 (들)과 함께 본 발명에 따른 백신을 포함하는 백신 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 개별, 순차적 또는 동시 투여를 위해 하나 이상의 다른 백신 (들)과 함께 본 발명에 따른 백신을 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명의 백신 또는 백신 조성물은 인간, 동물 또는 조류 대상체를 치료하는데 사용될 수있다. 예를 들어, 대상은 병아리, 닭 또는 마우스 (실험실 마우스, 예를 들어 형질 전환 마우스) 일 수있다.
일반적으로, 의사 또는 수의사는 개별 피험자 또는 피험자 그룹에 가장 적합한 실제 복용량을 결정하고 특정 피험자의 연령, 체중 및 반응에 따라 달라질 수 있습니다.
조성물은 임의로 제약 상 허용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 보조제를 포함 할 수있다. 약학 적 담체, 부형제 또는 희석제의 선택은 의도 된 투여 경로 및 표준 약학 실무와 관련하여 선택 될 수있다. 약제 학적 조성물은 담체, 부형제 또는 희석제, 임의의 적합한 결합제 (들), 윤활제 (들), 현탁 제 (들), 코팅제 (들), 가용 화제 (들), 및 바이러스의 전달 또는 면역 원성을 보조하거나 증가시킬 수있는 다른 담체 제제.
본 발명은 이제 실시 예에 의해 추가로 설명 될 것이며, 이는 본 발명을 수행하는데있어서 당업자에게 도움을주기위한 것이며 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니다.
실시 예 실시예 1-M41-CK에 기초한 IBV 역 유전학 시스템의 생성
M41-CK 전장 cDNA는 이전에 PCT / GB2010 / 001293 (본원에 참고로 포함됨)에 기술 된 백시 니아 바이러스 역 유전학 시스템에서 Beaudette cDNA를 M41 공통 서열로부터 유도 된 합성 cDNA로 대체함으로써 생성되었다.
Armesto, Cavanagh 및 Britton (2009)에 기술 된 재조합 백시 니아 바이러스 (rVV) rVV-BeauR-Rep-M41 구조 내의 IBV cDNA. PLoS ONE 4 (10) : e7384. doi : 10.1371 / journal.pone.0007384는 IBV Beaudette 균주에서 파생 된 복제물과 IBV M41-CK의 구조 및 액세서리 유전자 및 3 'UTR로 구성된 Beaudette 5'UTR-Nsp2-를 대체하여 추가로 수정되었습니다. IBV M41-CK의 상응하는 서열을 갖는 Nsp3 서열. 생성 된 IBV cDNA는 M41의 5 'UTR-Nsp2-Nsp3, Beaudette의 Nsp4-Nsp16 및 구조 및 보조 유전자 및 M41의 3'UTR로 구성되었습니다. 이 cDNA는 Beaudette Nsp4-Nsp16 서열의 결실에 의해 추가로 변형되었다. Nsp4-16이 결여 된 생성 된 cDNA를 4 개의 추가 단계에서 변형하여, 삭제 된 Nsp를 M41-CK로부터 상응하는 서열로 순차적으로 교체하고, 대체 cDNA는 M41-CK Nsp4-8, Nsp9-12, Nsp12-14 및 최종적으로 Nsp15-16을 나타냈다. 각 교체 cDNA에는 약 이전에 삽입 된 3 '가장 많은 M41 서열에 상응하는 5'말단에서 500 개의 뉴클레오티드 및 약. M41 S 유전자 서열에 상응하는 3 '말단에서 500 개의 뉴클레오티드. 이것은 상동 재조합에 의한 M41 cDNA 서열의 삽입 및 연속적인 M41 복제 유전자 서열의 순차적 첨가를 허용 하였다. M41- 유도 된 Nsp 서열을 함유하는 합성 cDNA를 본 발명자의 상기 기재된 일시적 지배적 선택 (IDS) 시스템을 사용하는 상동 재조합에 의해 첨가 하였다 (PCT / GB2010 / 001293 참조). M41 Nsps-10, -14, -15 및 -16에 상응하는 서열을 함유하는 M41- 유래 cDNA는 위치 85, 393, 183 및 209에 각각 변형 된 아미노산을 함유 하였다 :무화과. 10.
합성 서열을 나타내는 백시 니아 바이러스에서 M41-CK의 게놈을 나타내는 전장 cDNA가 생성되었다. 두 개의 rIBV, M41-R-6 및 M41-R-12가 구조되었으며 M41-CK와 유사한 방식으로 성장하는 것으로 나타났습니다 (무화과. 1).
실시 예 2-구조 된 M41 바이러스의 병원성 결정
감염 후 3-7 일에 매일 임상 징후에 의해 관찰되는 바와 같이, 실시 예 1에서 구제 된 바이러스를 8 일령의 특정 병원체 비 함유 (SPF) 병아리를 안구 및 코 접종에 의해 감염시켜 병원성을 시험하기 위해 사용 하였다. 감염 후 4 일 및 6 일에 섬모 활동을 위해. 섬모 활동의 상실은 IBV의 병원성을 결정하기 위해 잘 확립 된 방법입니다. 2 개의 M41-R 바이러스는 M41-CK와 비교할 때 무 병원 성인 것으로 밝혀졌지만, 감염되지 않은 대조군 병아리와 비교하여 약간의 임상 적 징후를 나타냈다 (무화과. 2) 및 섬모 활동의 일부이지만 일관되지 않은 손실 (무화과. 삼).
따라서, M41-CK의 M41-R 분자 클론은 모 바이러스 M41-CK와 비교할 때 병원성이 아니었다.
본 발명자들은 M41-CK 서열과 비교하여 M41-R의 여러 뉴클레오티드 차이를 확인 하였다. 뉴클레오타이드 변화가 서열과 관련된 단백질의 아미노산 서열에 영향을 미치지 않기 때문에 이들 중 대부분은 동의어 돌연변이였다. 그러나, 복제 유전자의 Nsp-10, Nsp-14, Nsp-15 및 Nsp-16 성분에 특이적인 IBV 복제 유전자에서 4 개의 비동의 돌연변이가 확인되었으며, 이들 돌연변이는 아미노산 변화를 초래 하였다 (표 3).

표 3 M41-R의 Nsp에서 확인 된 비동의 돌연변이 전장 게놈 지역 뉴클레오티드 뉴클레오티드 복제 위치 돌연 변이 아미노산 변화 Nsp10 12137 C → T 프로 → 류 Nsp14 18114 G → C 발 → 루 Nsp15 19047 T → A 레우 → 일 Nsp16 20139 G → A 발 → 일

실시 예 3-M41-R rIBV의 수리
확인 된 돌연변이가 M41-R과 관련된 병원성 손실의 원인인지를 결정하기 위해, Nsp10 돌연변이가 복구되었고 Nsp-14, -15 및 -16의 돌연변이가 복구되었고 유사한 방식으로 성장하는 것으로 나타났다. M41-CK (무화과. 9). 따라서, 본 발명자들은 본 발명자의 상기 기재된 (TDS) 시스템을 이용하여 정확한 뉴클레오티드를 함유하는 합성 cDNA를 사용하여 rIBV, M41R-nsp10rep 및 M41R-nsp14, 15, 16rep를 생성 하였다 (PCT / GB2010 / 001293 참조).
rIBV는 이전에 기술 된 바와 같이 병아리에서의 병원성에 대해 평가되었다. 두 rIBV는 M41-R과 비교했을 때 병원성이 증가했지만 M41-CK에서 관찰 된 수준은 아닙니다 (도. 4와 5). M41R-nsp14, 15, 16rep은 M41R-nsp10rep보다 더 많은 임상 적 징후와 섬모 활동 감소를 나타 냈으며, 전반적으로 이러한 결과는 4 개의 Nsp와 관련된 변화가 병원성에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다.
병원성에서 Nsp의 역할을 결정하기 위해, M41R-nsp10rep에 상응하는 전장 cDNA를 사용하여 TDS 시스템을 이용하는 정확한 뉴클레오티드를 함유하는 합성 cDNA를 사용하여 Nsps14, 15 및 16에서 돌연변이를 복구 하였다.
다음과 같은 rIBV가 생성되었습니다.
M41R-nsp10, 15rep-Nsp-10 및 Nsp-15 돌연변이가있는 M41-R
M41R-nsp10, 14, 15rep-Nsp-10, -14 및 -15에서 돌연변이가있는 M41-R
M41R-nsp10, 14, 16rep-Nsp-10, -14 및 -16에서 돌연변이가있는 M41-R
M41R-nsp10, 15, 16rep-Nsp-10, -15 및 -16에서 돌연변이가있는 M41-R
M41-K-네 가지 돌연변이 Nsp-10, -14, -15 및 -16 모두 M41-R에서 복구 됨
rIBV는 M41-CK와 유사한 방식으로 성장하는 것으로 나타났다 (무화과. 9) 및 전술 한 바와 같이 병원성을 평가 하였다. M41-K (네 개의 돌연변이가 모두 회복 된)는 감염 후 4 일까지 임상 징후와 섬모 활동의 100 % 손실 (완전한 ciliostasis)을 초래했습니다 (도. 6, 7 및 8). 다른 rIBV는 본질적으로 무 병원 성인 M41R-nsp10, 15, 16rep을 제외하고 다양한 수준의 병원성을 입증 하였다. 이들 결과는 4 개의 Nsp 모두의 복구가 M41-R에 대한 병원성을 회복 시켰음을 확인 하였다; 4 개의 Nsp에 기술 된 돌연변이가 M41-CK를 약화시키는 것과 관련이 있다는 이전의 증거를 다시지지한다.
본 발명자들은 또한 rIBV M41R-nsp 10, 14 rep (nsp 10 및 14는 수리, nsp 15 및 16은 돌연변이를 함유 함) 및 rIBV M41R-nsp 10, 16 rep (nsp 10 및 16은 수리하고 nsp 14 및 15는 돌연변이를 포함 함)를 생성 하였다 ) 및 이들 바이러스의 병원성을 평가 하였다.
rIBV M41R-nsp 10, 14 rep는 M41-K보다 병원성이 적지 만, 감염 후 4-6 일에 약 50 %의 간 경화증을 일으켰다. rIBV M41R-nsp 10, 16 rep은 거의 병원성이 없으며 간경변증을 유발하지 않았습니다.무화과. 11 a - c).
따라서 M41-R과 관련된 게놈은 합리적으로 약화 된 IBV에 대한 잠재적 인 백본 게놈입니다.
실시 예 4-M41-R을 사용한 백신 접종 / 챌린지 연구
후보 백신 바이러스는 수정 된 계란을 18 일의 배아에서 난에서 백신 접종하고 접종 된 난의 부 화성을 결정한 연구에서 시험되었다. 닭의 임상 건강을 조사하고 닭을 21 일령에 용량 당 10 3.65 EID 50 의 악성 IB M41 챌린지 바이러스로 챌린지 하였다 .
백신에 의한 챌린지 보호 후 임상 징후를 조사하고, 챌린지 바이러스가 섬모의 움직임에 대한 챌린지 바이러스의 효과 및 섬모 정체에 대한 백신에 의한 보호 (섬모 운동의 억제)를 조사하기 위해 챌린지 후 5 일에 시아 노 스타 시스 시험을 수행 하였다.
상용 육계 계란의 Ovo 예방 접종
실험 설계는 표 4에 제공되고 임상 결과는 표 5에 제공된다. IB M41-R로 접종 된 난의 부 화성은 양호하고 닭은 건강했다. IB M41-R은 육계에 도전 한 후 임상 징후로부터 보호됩니다 (위약 : 19/19, 영향을받은 1B M41-R : 3/18 및 사망 1). ciliostasis 테스트 결과는 표 6에 나와 있습니다. ciliostasis에 대한 IB M41-R 생성 보호.

표 4 상업용 계란의 부 화성, 안전성, 효능 연구 설계 EID 50 1 노선 일 일 종료 Nr. 의 치료 당 의 의 의 의 계란 치료 기술 정량 관리자 관리자 도전 2 연구 치료 T01 없음 NA NA NA NA NA 30 T02 IB M41-R 10 4 오보에서 18 일 21 일 26시 30 NTX 식염 NA 오보에서 태아- 만 20 세 일 30 민족 닭 시대의 그룹당 1 복용량 0.1 ml, NA, 해당 없음. 용량 당 2 10 3.65 EID 50 .


표 5 전후의 해치 백분율 및 임상 데이터 상업용 닭의 도전, 디자인은 표 1을 참조하십시오. 전에 후 도전 도전 해치/ 치명적인/ 죽음 / 조짐/ 죽음 / 조짐/ 치료 합계 합계 합계 합계 합계 합계 없음 28/30 혈액 수집을위한 해치 직후 안락사 IB M41-R 28/30 28/28 1/20 0/19 1/19  3/18 1, 7 식염 29/30 29/29 1/20 0/19 0/19 19/19 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 1 방해 호흡기 2 휘파람 3 목소리의 변화 4 호흡 곤란 5 개의 안와 내 부비동 6 고르지 못한 성장 약한 7


표 6 챌린지 후의 간경변 검사 결과, 설계는 표 1을 참조하십시오. 치료 보호 / 총 백분율 보호 식염 0/19  0 % IB M41R 5/18 28 %

특정 병원균이없는 (SPF) 난에서 Ovo 예방 접종
SPF 계란의 연구의 설계는 표 7에 주어진 및 상업 육계와 연구의 디자인과 유사하지만, 1B M41-R에 대한 예방 접종 용량은 (10, 더 높았다되어 5 EID 50 복용량 당).
결과 (표 8)는 IB M41-R 해치의 해치 백분율이 낮았으며, 40 개 중 19 개가 부화되었고 병아리가 약함을 보여줍니다. 여덟 마리가 죽었다. 나머지 11 마리의 닭에 도전하고 식염수를 접종 한 알에서 부화 한 병아리 11 마리에 도전했다.
도전 후의 간경변 시험에서, IB M41-R로 난소에서 백신 접종 된 모든 닭은 보호 된 반면, 대조군 중 어느 것도 보호되지 않은 것으로 나타났다 (표 9 참조).

표 7 SPF 계란의 부 화성, 안전성, 효능 연구 설계 EID 50 1 노선 일 일 종료 Nr. 의 치료 당 의 의 의 의 계란 치료 기술 정량 관리자 관리자 도전 2 연구 치료 T01 IB M41-R 10 5 오보에서 18 일 21 일 26시 40 태아- 시대의 일 T04 식염 NA 오보에서 민족 시대의 40 NTX NA NA NA NA 10 1 복용량 0.1 ml, NA, 해당 없음. 0.2 ml 중 2 챌린지 용량 10 3.3 EID 50 .


표 8 전후의 해치 백분율 및 임상 데이터 SPF 닭의 도전, 디자인은 표 7을 참조하십시오. 전에 후 도전 도전 해치/ 치명적인/ 죽음 / 조짐/ 죽음 / 조짐/ 치료 합계 합계 합계 합계 합계 합계 IB M41-R 19/40 11/40 8/40 약한 0 0 식염 30/40 30/40 0 — 0 0 NA  9/10  9/10 0 — — —


표 9 챌린지 후의 폴리오 스타 시스 시험 결과, 설계는 표 7을 참조하십시오. 치료 보호 / 총 백분율 보호 식염  0/11  0 % IB M41R 11/11 100 %

결론적으로, IB M41-R은 상업용 난에서 안전하고 임상 징후에 대한 보호 및 간경변에 대한 보호를 생성 하였다.
SPF 계란에서 IB M41 R로 백신 접종을 한 비교적 적은 수의 닭이 부화했습니다. 이는 사용 된 1B M41-R의 난당 10 5 EID 50 때문일 수 있습니다 . 이것은 부 화성이 더 높은 초기 연구에서 사용 된 용량보다 10 배 높았습니다. 다른 연구에서 배아 사망률 수준이 이전에 관찰 된 것보다 높았 기 때문에, 바이러스에 대한 SPF 알의 배치의 특히 높은 감수성에 의해 해치 백분율이 낮아질 수있다.
도전 후 부화 후 살아남은 모든 닭은 ciliostasis로부터 완전히 보호되었다. IB M41-R은 백신이 백신으로 투여 될 가능성이 크다고 결론 지었다.
상기 명세서에서 언급 된 모든 간행물은 본원에 참고로 포함된다. 기술 된 본 발명의 방법 및 시스템의 다양한 수정 및 변형은 본 발명의 범위 및 사상을 벗어나지 않으면 서 당업자에게 명백 할 것이다. 본 발명은 특정 바람직한 실시 예와 관련하여 설명되었지만, 청구 된 본 발명은 이러한 특정 실시 예에 과도하게 제한되어서는 안된다는 것을 이해해야한다. 실제로, 분자 생물학, 바이러스학 또는 관련 분야의 숙련자에게 명백한 본 발명을 수행하기위한 기술 된 모드의 다양한 변형은하기 청구 범위의 범주 내에있는 것으로 의도된다.
클레임
비 구조 단백질 (들) nsp-10 및 nsp-14 중 하나 또는 둘 다에서의 돌연변이를 포함하는 다 단백질을 암호화하는 변이 복제 유전자를 포함하는 생 약독 화 코로나 바이러스-상기 변이 복제 유전자는 아미노산 돌연변이를 포함하는 단백질을 암호화 함- 서열 번호 : 6의 위치 85에 해당하는 위치에서 Pro에 의해 Leu 로의 변이, 및 / 또는 변이체 복제 유전자는 서열 번호 : 3의 위치 393에 해당하는 위치에서 Val to Leu의 아미노산 돌연변이를 포함하는 단백질을 암호화한다. 7.
제 1 항에있어서, 변이체 복제 유전자는 :
서열 번호 : 8의 위치 183에 해당하는 위치에서 Leu에서 Ile 로의 아미노산 돌연변이; 과서열 번호 9의 위치 209에 해당하는 위치에서 Val 대 Ile의 아미노산 돌연변이
제 1 항에있어서, 상기 레플리카 제 유전자는 서열 번호 7의 위치 393에 상응하는 위치에서 아미노산 돌연변이 Val 내지 Leu를 포함하는 단백질을 암호화하고; 서열 번호 : 8의 위치 183에 해당하는 위치에서 Leu 내지 Ile; 및 서열 번호 9의 위치 209에 해당하는 위치에서 Val to Ile.
제 1 항에있어서, 상기 레플리카 제 유전자는 서열 번호 6의 85 번 위치에 상응하는 위치에서 Leu에 아미노산 돌연변이를 포함하는 단백질을 암호화하고; 서열 번호 : 7의 위치 393에 해당하는 위치에서 Val 내지 Leu; 서열 번호 : 8의 위치 183에 해당하는 위치에서 Leu 내지 Ile; 및 서열 번호 9의 위치 209에 해당하는 위치에서 Val to Ile.
제 1 항에있어서, 상기 복제 유전자는 서열 번호 1로 나타낸 서열과 비교하여 선택된 하나 이상의 뉴클레오티드 치환을 포함하는 코로나 바이러스.
C 내지 Tat 뉴클레오티드 위치 12137; 과뉴클레오티드 위치 18114에서 G 내지 C;서열 번호 1로 나타낸 서열과 비교;임의로, 뉴클레오티드 위치 19047에서 T로부터 A로 선택된 하나 이상의 뉴클레오티드 치환을 포함하고; 과뉴클레오티드 위치 20139에서 G 내지 A;
제 1 항에있어서, 감염성 기관지염 바이러스 (IBV) 인 코로나 바이러스.
제 1 항에있어서, IBV M41 인 코로나 바이러스.
제 7 항에있어서, 적어도 일부는 M41 이외의 IBV 혈청 형 유래의 S 단백질을 포함하는 코로나 바이러스.
제 8 항에있어서, S1 서브 유닛이 M41 이외의 IBV 혈청 형으로부터 유래 된 코로나 바이러스.
제 8 항에있어서, S 단백질이 M41 이외의 IBV 혈청 형으로부터 유래 된 코로나 바이러스.
제 1 항에있어서, 상응하는 야생형 복제물을 발현하는 코로나 바이러스에 비해 병원성이 감소 된 코로나 바이러스로서, 상기 바이러스는 배아 알에 투여 될 때 배아에 병원성이없는 복제가 가능한 것 인 코로나 바이러스.
제 1 항에 정의 된 변이 복제 유전자.
제 12 항에 따른 변이 코로나 바이러스 복제 유전자에 의해 암호화 된 단백질.
제 12 항에 따른 복제 유전자를 포함하는 플라스미드.
제 1 항에있어서,하기 단계를 포함하는 코로나 바이러스의 제조 방법 :
(i) 제 14 항에 따른 플라스미드를 숙주 세포 내로 형질 감염시키는 단계;(ii) 복제 세포로 코로나 바이러스 균주의 게놈을 포함하는 재조합 바이러스로 숙주 세포를 감염시키는 단계;(iii) 플라스미드의 복제 유전자 서열과 재조합 바이러스 게놈의 상응하는 서열 사이에 상동 재조합이 일어나 변형 된 복제 유전자를 생성하는 단계; 과(iv) 변형 된 복제 유전자를 포함하는 재조합 바이러스를 선별하는 단계.
제 15 항에있어서, 재조합 바이러스가 백시 니아 바이러스 인 방법.
제 15 항에있어서, 상기 단계를 또한 포함하는 방법 :
(v) 단계 (iv)의 재조합 바이러스로부터 DNA로부터 변형 된 복제 유전자를 포함하는 재조합 코로나 바이러스를 회수하는 단계.
제 1 항에 따른 코로나 바이러스를 생산할 수있는 세포.
제 1 항에 따른 코로나 바이러스 및 약제 학적으로 허용되는 담체를 포함하는 백신.
제 19 항에 따른 백신을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 질환을 치료 및 / 또는 예방하는 방법.
제 20 항에있어서, 질환이 감염성 기관지염 (IB) 인 방법.
제 20 항에있어서, 투여 방법이하기로 이루어진 군으로부터 선택되고; 점안제 투여, 비강 내 투여, 식수 투여, 해치 후 주사 및 난내 주사.
제 21 항에있어서, 투여가 난소 백신 접종 인 방법.
제 19 항에있어서, 제 18 항에 따른 세포를 제 1 항에 따른 코로나 바이러스로 감염시키는 단계를 포함하는 백신의 제조 방법.
제 1 항에있어서, nsp-15 및 nsp-16 중 하나 또는 둘 다에 돌연변이를 추가로 포함하는 코로나 바이러스.
인용 인용
미국 특허 문서
74525422008 년 11 월 18 일데니슨
외국 특허 문서
WO-2004 / 0923602004 년 10 월WOWO-2005 / 0498142005 년 6 월WOWO-2007 / 0782032007 년 7 월WOWO-2011 / 0041462011 년 1 월WO
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특허 연혁
특허 번호 : 10130701
유형 : 그랜트
신청 : 2015년 7월 23일
특허 날짜 : 2018년 11월 20일
특허 공개 번호 : 20170216427
담당자 : PIRBRIGHT 연구소 (워킹, Pirbright)
발명자 : 에리카 비 커튼 (워킹), 사라 보관할 것 (워킹) 폴 브리튼 (Woking)
1 차 심사관 : Bao Q Li
출원 번호 : 15 / 328,179
분류
현재 미국 분류 : 코로나 비리 대 (예를 들어, 신생아 송아지 설사 바이러스, 고양이 감염성 복막염 바이러스, 개 코로나 바이러스 등) (424 / 221.1) 국제 분류 : A61K 39/215 (20060101); C12N 7/00 (20060101); C12N 9/12 (20060101); A61K 39/00 (20060101);